（1）取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，做活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1╳10个细胞/L，然后根据实验要求做梯度倍数稀释。

（2）用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。

（3）按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2╳DMEM培养基（含有2╳抗生素和20%的小牛血清）混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中（10cm平皿加7-10mL），冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

（4）按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2╳DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10-14天。

（5）把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。

软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。

（6）注意事项

1.接种时细胞密度适度，不可过高。

2.上层软琼脂使细胞分散成单个，下层软琼脂作为支撑防止细胞贴附生长。最后铺上一层培养基是为了防止胶干燥，并给细胞补充营养，如果做药物处理，则在培养基中加入药物；

3.上层胶细胞数目根据不同的细胞类型而定。一般以5000个细胞/孔作为起始浓度，根据需要调整；

4.琼脂放入水浴锅中维持在42℃左右。温度过低琼脂凝固，在做基底时琼脂凝固过快会导致不均一，温度过高则会将细胞烫死。此外，实验过程中速度要快，防止局部结块；应使下层琼脂充分凝固后，再浇上层琼脂，以避免上层琼脂培养基中的细胞进入下层琼脂中；

5.浇上层琼脂时操作要迅速，以免液体过凉导致上下分离；

6.操作中不能产生气泡。

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